Especificidad de la técnica HPLC para la evaluación de la estabilidad química del sólido pulverulento de Parthenium hysterophorus, Linn, en base a partenina (página 2)

Estudio de
estabilidad. Condiciones de estrés

Procedimiento experimental. Se
pesó tres réplicas correspondientes a 0,1 g del
sólido pulverulento se colocaron en frascos ámbar y
protegidos de la luz, y se
mantuvieron durante tres meses en las siguientes
condiciones:

Estudio de estabilidad acelerada: 40°C
± 2°C/75% ± 5% HR. Condición del envase:
frasco ámbar con tapón de goma protegido de la luz.
(ICH, 2003)

Ensayo de estrés de
humedad: 25°C ± 2°C/80% ± 5% HR
(ICH, 2003). Condición del envase: frasco destapado
protegido de la luz.

Estabilidad a largo plazo: 30°C
± 2°C/65% ± 5% HR (ICH, 2003). Condición
del envase: frasco ámbar con tapón de goma
protegido de la luz.

Preparación de las muestras de ensayo:
Coincide con lo reportado anteriormente.

Análisis de las características
organolépticas: Se observó el comportamiento
organoléptico, teniendo en cuenta el olor, color y aspecto
de los sólidos pulverulentos a tiempo inicial
y a los tres meses.

Análisis Químico: Se aplicó
la técnica de determinación cuantitativa de
partenina en los sólidos pulverulentos de Parthenium
hysterophorus, Linn., mediante HPLC desarrollada para
determinar el contenido de su principal ingrediente activo, la
partenina, a tiempo inicial y a los tres meses. Se realizó
el cálculo
del por ciento sin degradar de partenina con relación a su
concentración en la muestra inicial a
tiempo cero.

Estabilidad
acelerada y de vida estante

Procedimiento experimental.
Se pesó tres réplicas correspondientes a 0,1 g del
sólido pulverulento se colocaron en frascos ámbar y
protegidos de la luz, y se mantuvieron durante tres meses en las
siguientes condiciones:

Estudio de estabilidad acelerada: 40°C
± 2°C/75% ± 5% HR. Condición del envase:
frasco ámbar con tapón de goma protegido de la luz.
(ICH, 2003)

Estabilidad a largo plazo: 30°C
± 2°C/65% ± 5% HR (ICH, 2003). Condición
del envase: frasco ámbar con tapón de goma
protegido de la luz.

Análisis de las características
organolépticas: Se observó el comportamiento
organoléptico, teniendo en cuenta el olor, color, sabor y
aspecto de los sólidos pulverulentos a tiempo inicial y a
los tres meses.

▲ Análisis Químico: Se
aplicó la técnica de determinación
cuantitativa de partenina en los sólidos pulverulentos de
Parthenium hysterophorus, Linn., mediante HPLC para
determinar el contenido de su principal ingrediente activo, la
partenina, a tiempo inicial y a los tres meses. (Polin L., 2006).
Se realizó el cálculo del por ciento sin degradar
de partenina con relación a su concentración en la
muestra inicial a tiempo cero.

Especificidad de la técnica
analítica HPLC para estabilidad

Se evalúo la especificidad de la técnica
analítica HPLC con vistas a su aplicación en
estudios de estabilidad del sólido pulverulento y se
valoró
la posible interferencia de productos de
degradación con relación a la respuesta
cromatográfica del ingrediente activo principal. Se
valoró el perfil cromatográfico de cada
condición analizada, al ser sometidas las muestras de
ensayo a
degradaciones en diferentes condiciones extremas que propicien la
degradación del ingrediente activo. Para ello se evaluaron
las respuestas cromatográficas a cada condición
analizada, al ser sometidas las muestras de ensayo a
degradaciones en diferentes condiciones de estrés como:
medio ácido (HCl 1mol/L), medio básico (NaOH 1
mol/L), oxidación (H2O2 al 3 %), la
luz solar y ultravioleta, teniendo en cuenta lo referido en las
normas de la
conferencia
internacional de armonización (ICH, 1996) al evaluar la
especificidad de técnicas
de análisis frente a posibles productos de
degradación.

El cromatograma obtenido mediante HPLC de la sustancia
de referencia y de la muestra inicial a tiempo cero, evidencian
un pico cromatográfico bien definido y resuelto a un
tiempo de retención de 5,2 correspondiente al ingrediente
activo de interés.
(Fig. 2 y 3).

• Medio básico: Se obtiene
  un pico en el cromatograma obtenido mediante HPLC a un tiempo
  de retención (tr) de 7,2 min, lo cual podría
  darnos un criterio de la presencia de un producto de
  degradación de menor polaridad con relación al
  ingrediente principal, la partenina. Los resultados de la
  concentración de ingrediente activo (%) muestra una
  reducción significativa con relación al contenido
  de partenina en la muestra sin degradar. (Tabla 2) (Tabla 3)
  (Fig. 2)

Tabla 2. Valores
de concentración (%) para la muestra de análisis a
tiempo cero.

Tabla 3.
Concentración de partenina (%) en el sólido
pulverulento y % de partenina sin degradar en relación a
su concentración inicial.

• Medio ácido: Se obtiene un
  pico en el cromatograma obtenido mediante HPLC a un tiempo de
  retención (tr) de 6,3 min, bien definido, sin colas, ni
  solapamientos. Los resultados de la concentración de
  ingrediente activo (%) muestran una reducción
  significativa con relación al contenido de partenina en
  la muestra inicial a tiempo cero. (Tabla 2) (Tabla 3) (Fig.
  3)

Medio oxidante: Se obtiene un pico en el
cromatograma HPLC a un tiempo de retención (tr) de 7,3
min., con ausencia de picos solapados. Los resultados de la
concentración de ingrediente activo (%) muestran una
reducción significativa con relación al contenido
de partenina en la muestra sin degradar. (Tabla 2) (Tabla 3)
(Fig. 4)

Luz solar: Se obtiene un pico en el
cromatograma HPLC a un tiempo de retención (tr) de 7,05
min., con ausencia de picos solapados. Los resultados de la
concentración de ingrediente activo (%) muestran la no
existencia de diferencias significativas con relación al
contenido de partenina en la muestra sin degradar. (Tabla 2)
(Tabla 3) (Fig. 5)

Luz UV: Se obtiene un pico en el cromatograma
HPLC a un tiempo de retención (tr) de 7,71 min, con
ausencia de picos solapados, lo cual evidencia la
formación de un posible producto de degradación de
estructura
química
similar y de una menor polaridad, teniendo en cuenta las
condiciones cromatográficas establecidas. Los resultados
de la concentración de ingrediente activo (%) muestran una
reducción significativa con relación al contenido
de partenina en la muestra sin degradar. (Tabla 2) (Tabla 3)
(Fig.6)

Fig. 6. Cromatograma HPLC obtenido para
la muestra de análisis bajo el efecto de la luz artificial
(UV).

El análisis comparativo de los cromatogramas
obtenidos para la sustancia de referencia, muestra inicial a
tiempo cero y las muestras sometidas a las condiciones de
degradación drásticas, demuestra la especificidad
del método
analítico HPLC, al no evidenciarse interferencias, ni
solapamientos con relación al pico que eluyó a un
tiempo de retención de 5,2 min correspondiente al
ingrediente activo principal.

Atendiendo a los resultados obtenidos, se evidencia la
mayor incidencia en la concentración de la partenina de la
condición degradativa en medio básico, que alcanza
prácticamente el 80 % de degradación, seguida de la
degradación oxidativa, posteriormente del medio
ácido y finalmente se muestra que la menor
afectación de la concentración del ingrediente
activo principal se obtiene bajo el efecto de la luz artificial y
luz solar.

Cromatografía en capa delgada cualitativa
(CCD)

La determinación de las razones de flujo (Rf) de
cada una de las muestras analizadas, sometidas a las diferentes
condiciones degradativas en comparación con la
solución de referencia evidenció los siguientes
resultados:

• Medio básico: Aparición de una
  mancha fluorescente a la luz ultravioleta a un valor de Rf de
  0,67. Se evidenció la presencia a la luz ultravioleta de
  una segunda mancha fluorescente a un valor de Rf de 0,98, no
  siendo detectada al revelado con vainillina.

• Medio ácido: Aparición de una
  mancha fluorescente a la luz ultravioleta y de color carmelita
  al revelado con vainillina a un valor de Rf de 0,125. Se
  evidenció la presencia de una segunda mancha
  fluorescente a la luz ultravioleta y de color verde al revelado
  con vainillina a un valor de Rf de 0,93.
• Medio oxidante: Aparición de una mancha
  fluorescente a la luz ultravioleta y de color carmelita al
  revelado con vainillina a un valor de Rf de 0,26. Se
  evidenció la presencia de una segunda mancha
  fluorescente a la luz ultravioleta, no siendo detectada al
  revelado con vainillina a un valor de Rf de 0,98.

Se evidencia atendiendo a los resultados anteriores, la
presencia de posibles productos de degradación en cada
medio analizado, detectándose dos nuevas sustancias en
cada condición, en comparación con la sustancia de
referencia fluorescente a la luz ultravioleta y de
coloración azul violácea al asperjado con
vainillina, presentando un valor de Rf de 0,5.

Espectrofotometría ultravioleta
directa

• Muestra inicial a tiempo
  cero.

El espectro UV del sólido pulverulento en metanol
en el intervalo de 200 a 300 nm evidenció la presencia de
un máximo de absorción a una longitud de onda de
215 nm, correspondiente a una transición
(π-π*)
característico de las enonas. (Fig.7)

Fig. 7. Espectro UV del sólido
pulverulento del Parthenium hysterophorus, Linn en
metanol.

• Medio ácido y básico.
  Caracterización espectrofotométrica
  cualitativa.

El espectro UV de la muestra objeto de análisis
sometida a la degradación en medio ácido
mostró la presencia un máximo de absorción a
una longitud de onda de 206 nm. (Fig.8)

El espectro UV de la muestra sometida a la
degradación en medio alcalino evidenció la
presencia un máximo

▲ Solubilidad del producto
cristalizado.

El producto cristalizado en forma de finas agujas
blanquecinas, es soluble en ácido clorhídrico 1 % y
en agua, lo cual
pudiera inducirnos a concluir que se obtuvo bajo esta
condición una sal, teniendo en cuenta las consideraciones
teóricas sobre un posible mecanismo de degradación
en medio básico.

• Medio oxidante. Caracterización
  espectrofotométrica cualitativa.

El espectro UV de la muestra sometida a la
degradación oxidativa con peróxido de hidrógeno al 3 %, evidenció la
presencia de un máximo de absorción a una longitud
de onda de 221 nm, correspondiente a una transición
(π-π*),
lo cual corroboró el pico característico de las
enonas entre 215- 250 nm. (Fig.10)

Fig. 10. Espectro UV de la muestra de
análisis sometida a degradación en medio
oxidativo.

Los espectros UV obtenidos como resultados de la
evaluación de las muestras sometidas en
cada medio de degradación (ácido, básico,
oxidativo) mostraron máximos de absorción,
característicos de la banda de transición
(π-π*) de
las enonas, lo cual infiere la presencia de posibles productos de
degradación de estructura química similar a la
partenina y confirma, además, que éste
método analítico no es recomendable en la
realización de estudios de estabilidad del sólido
pulverulento.

Autor:

Msc. Yanelis Saucedo Hdez

Lic. Bassam Mohamad Safa

Dra. Mirtha Mayra González
Bedia

Dr. Dr. Luis Ramón
Bravo Sánchez

Dra. Elisa Jorge Rodríguez

Téc. Adalberto Quintana

Téc. Ana Hernández
Monzón

Universidad Central de las Villas. Departamento
Farmacia. Facultad de Química Farmacia. Cuba.